从2010年回国至今整整10年，北京生命科学研究所研究员何万中终于在黑暗中探出了一道光，给自己和支持者们上交了一份满意“答卷”。

这道光就是，他带领团队原创性地开发了一种新型克隆电镜标记技术，该技术可直接在细胞中遗传编码表达的标记蛋白上原位合成纳米金颗粒，从而实现细胞超微结构上单分子水平的精确识别与定位，为细胞的电镜超微结构单分子水平研究提供了新工具。

北京时间2020年8月10日晚23时，相关研究成果在线发表于《自然—方法》。

何万中称这10年是一场“大冒险”，“原创探索不仅没有效率，还要顶着压力和风险，有的只是坚持只做真正原创工作的信念。”

3年没有成果，“逼”走了一位工程师

电镜超微结构水平细胞中的单分子可视化技术是细胞生物学家期盼已久的工具。

当今，生命科学已进入分子生物学时代，人们对生命现象的研究已经深入到单细胞、单分子的纳米尺度水平，如何在这样的尺度范围内定位、识别、操纵目标分子，从而获取功能性的生物化学信息，将对生命现象的解读等意义重大。

论文通讯作者何万中告诉《中国科学报》，近50年来，识别细胞中的蛋白质分子主要依赖传统的抗体免疫金标记技术，但受到抗体及抗原的稳定性和特异性、化学固定剂、细胞切片渗透性、胶体金颗粒大小等因素影响，该技术通常标记效率很低(低于10%)，甚至无法标记，多数情况也只能标记上细胞切片表面的极少部分抗原，且还要受到背景噪声干扰。

此外，传统免疫标记需要标记每一个切片，对于细胞组织样品大尺度的标记是十分费钱、费时、费力的工作。

超分辨率荧光显微学成像技术发展，使得单分子水平的细胞成像成为现实，不过，其也只能对有标记的少数分子成像，对没有标记的多数分子甚至细胞器成像时仍是一片“模糊”。

因此，细胞生物学家迫切希望电镜领域也能够开发出类似光学显微成像领域广泛应用的绿色荧光蛋白（GFP）标记技术，通过遗传操作来实现细胞及生物组织在电镜超微结构样品上的分子识别和精确定位。科学家将这种技术称为“基于遗传编码的可克隆电镜标记技术”。

为此，科学家们尝试探索开发可克隆电镜标记，比如：利用重金属离子直接与标记蛋白（包括富含半胱氨酸的金属结合蛋白、铁蛋白多聚合体等）结合形成纳米金属颗粒示踪的方式。在电镜下，纳米金属颗粒表现为一个“大黑点”，类似荧光显微成像的绿色荧光蛋白，可让目标分子从细胞中无数分子中“脱颖而出”。

2007年，何万中在美国加州理工学院做博士后时，发明了冷冻细胞内吞纳米金颗粒原位增大技术，可在超微结构水平示踪每个被细胞内吞的抗体共价交联的1.4纳米金簇，相关成果在《自然》杂志刊发。不过，该技术基于细胞内吞机制，并不适合标记细胞内部绝大多数分子。

此时，他敏锐地注意到2006年David DeRosier博士刚刚提出的基于富含半胱氨酸的金属蛋白（MT）的开发可克隆电镜标记新概念极具潜力解决上述问题，随后，何万中独立组建实验室，立刻着手将MT改造成更好的MTn和MTa，从此走上了长达十年的可克隆电镜标记技术漫长而艰辛的开发之路。

事实上，国际上有5个团队先后对该技术有过探索，但因诸多技术障碍没有攻克，如存在无可避免的“背景噪声”导致特异性差，金离子无法有效进入细胞，不耐化学固定剂，合成纳米金颗粒效率低且颗粒极小等，因此，迄今无人开发成功细胞超微结构单分子水平的可克隆电镜标记技术。

2010年，入职北京生命科学研究所后，何万中建立团队开始致力于攻克上述难题。

经历3年艰难探索，始终存在的非特异性背景噪声成为他们迟迟难以突破的技术障碍，其中一位负责该金颗粒合成的工程师认为成功希望渺茫，无奈之下，他放弃项目离开了团队。

何万中不甘心就此止步，“概念有了，就是一步步解决这个关键问题的事儿，我相信肯定能够解决的。”

图：何万中和三位第一作者（从右至左：何万中，姜招弟，金秀梅，李玉华）

“意外的收获”

做生物物理学交叉研究多年的何万中，决定自学化学知识攻克这个难题，他把自己关在办公室研读化学文献。